AJS2001治疗晚期癌症生物工程计划

蒋金阳 发表于 2009-6-13 10:35:16

摘要 在此项生物工程计划中，AJS2001将作为一种能够有效转导（TRANSDUCTION）人的癌细胞的生物载体，治疗各种人的晚期恶性肿瘤。试验治疗的患者，大部分或全部都可能经过了目前所能提供的常规癌的治疗，这包括手术切除癌肿块, 化学药物治疗，和同位素放射线治疗等，并已经被证明医治效果很差或无效。AJS2001对癌症的治疗属于基因治疗范畴，其目的就是让受试患者的病情能够得到缓解，甚至能得到较长时间的好转。受试患者将被检定能否避免或减轻由于抗肿瘤化学药物治疗或放射线治疗或外科手术所带来的正常机体的功能损坏和丧失，更重要的是检定受试患者能否从晚期恶性肿瘤的状态下逐渐恢复，重新获得类似正常人的生活。受试患者的两年生存率将是衡量此试验治疗的最主要指标。 科学依据和理由 尽管对癌的发病机制有了很多新的了解和认识，但目前人的癌的治疗均属于非机理性的消除癌病灶的方式，基本上没有效果或效果很差，因此研究和发展新的治疗方法和途径，尤其以癌病变机理为基础施治的途径亟待解决。无论新的治疗癌症的方法和途径是什么一种形式，其原则是在最大效率地抑制恶性肿瘤生长的同时，尽可能地保护患者的正常组织和细胞的功能。 AJS2001是重组的HIV-1病毒，它能够有效感染几乎全部人体的各种组织的细胞，但在感染细胞内没有病毒复制的能力，也不会引起艾滋病的病变。AJS2001的基因组中装载有人的端粒体逆转录酶（HUMAN TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE，hTERT）的基因转录驱动成份（1），由其控制被感染细胞内的病毒（PROVIRUS）的基因表达。最新型AJS2001能够表达人的CDC6短发夹式RNA（shRNA），抑制产生细胞DNA复制蛋白CDC6，从而引起被感染细胞发生终末分化（TERMINAL DIFFERENTIATION），细胞自身死亡（APOPTOSIS），以及细胞增殖能力丧失（SENESCENCE）。根据这种特异作用机制，AJS2001将被用于抑制癌细胞的恶性生长。 AJS2001的治疗特点 AJS2001是用其特异HIV-1基因组载体与被膜蛋白表达载体在体外培养的人的细胞内包装产生。它具有很强的感染性，但在感染细胞内无复制功能。它经过提纯与浓缩后，便可直接注射入患者的癌病灶内或由血液输入全身。一个生长了六年的肿瘤组织湿重约50克，含320亿个细胞，而每注射一毫升的制剂，可输入10亿个病毒颗粒，能有效地感染2亿5千万个癌细胞。注射病毒后一周左右，由于病毒感染的结果，癌细胞产生大量的病毒蛋白质，导致细胞生长被抑制，其中具有阻断细胞增殖周期作用的蛋白质又可造成邻近未被感然的癌细胞生长停滞。这种治疗可在两到三周内重复进行，最终癌症肿块经炎症反应开始缩小或彻底消失。 I．AJS2001研制开发 1．主要经历 AJS2001的载体的设计和组装于1986年开始（2），于2000年在美国加利福里亚州进入实质性的分子克隆阶段。当年完成了AJS2001第一个载体P1102的构建和载体鉴定。并于2001年5月进行了小鼠体内毒性实验和抑制肿瘤生长实验。2001年下半年完成了更新的载体THTN的构建和鉴定，细胞生物学和分子生物学的实验证实了THTN抑制癌细胞增殖的作用。2002年6月以中国山东青岛RNTEIN生物工程公司名义参加了美国基因治疗学术会议，用墙报和摘要形式发表了THTN的研制结果（3）。随后AJS2001被研制人员先后三次用于他们在中国的亲属晚期恶性肿瘤的替代治疗。2005年3月AJS2001最具抑制癌细胞生长，并能稳定表达CDC6shRNA的第三代载体THTD构建完成，研究表明THTD对人的癌细胞起到诱导自身死亡作用和丧失增殖能力的作用，它的作用机制与重新激活细胞内正常的抑制肿瘤蛋白质有非常直接的关系。2005年11月，THTD很快被用于研制人员亲属晚期恶性肿瘤的治疗中。从2006年6月至今，THTD在日本东京由GREEN LIFE STAR INC.主导，开展了第一期实验治疗，到现在为止，60多位不同晚期癌症的患者接受了实验治疗。 2．AJS2001的制备和鉴定 重组的AJS2001是用携带病毒基因组的质粒（PLASMID）与产生非同源性的VESCULAR STOMATITIS VIRUS 膜G糖蛋白（VSV-G）表达质粒共同转染（TRANSFECTION）人的肾胚胎293T细胞而得到的。临床试验治疗所用的AJS2001病毒还需经过MATRIX MADIATED PRECIPITATION（MMP）技术浓缩和纯化。重组的AJS2001病毒的滴度（TITER）用检定HIV-1病毒P24含量来衡定。病毒的感染活性（INFECTIVITY）以测定对人的乳腺癌MCF7细胞诱导产生SENESCENCE-ASSOCIATED HETEROCHROMATIC FOCI （SAHF）来确定。 3．AJS2001制剂特性 经过MMP技术浓缩和纯化，AJS2001溶于1倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS），并经过0.45微米滤器过滤除菌。100倍浓缩的AJS2001病毒制剂为透明状液体，呈微黄色。用于临床试验治疗的制剂以500和1000微升两种体积分装，病毒的活性通常在500x103 SAHF/ml（相当于0.5-3x107CPU/ml）。纯化的AJS2001病毒应冻存于-80°C，有效期为6个月。纯化的AJS2001在4°C低温较稳定，其活性在一周时间里下降50%。但在37°C时，其活性只能保持约24小时。AJS2001病毒对冻冰过程较敏感，易受到损害，甚至失去活性。因此不应将AJS2001置于0-20°C保存。 4．AJS2001的生物学 AJS2001具有HIV-1病毒的许多性质，但两者存在本质的区别。HIV-1感染人的CD4受体阳性的细胞，对阴性的细胞没有感染作用。HIV-1病毒在被感染的细胞内将其RNA逆转录成双链的cDNA，并通过其特殊的整合酶（INTEGRASE）一系列的酶促作用，病毒的cDNA最终稳定地嵌入被感染的细胞染色体DNA中。在合适的条件下，这些HIV-1的PROVIRUS开始表达病毒的RNA和蛋白质，并经过修饰和加工，最终装配成新的病毒颗粒，当它们被遣送出细胞后，又对其他的，更多的细胞感染。因此，HIV-1病毒的感染和病毒的复制不断进行，在每一个复制周期过程中，造成细胞结构和功能的严重受损，最终使被感染的细胞死亡和消失。 与HIV-1不同，AJS2001通过VSV-G蛋白的“假”包装（PSEUDOTYPE）而成。虽然能够感染几乎所有人的组织和细胞，但它不具备HIV-1那样的GP120被膜蛋白（ENVOLOPE）。 GP120能造成被感染的细胞膜相互融合，导致细胞结构和功能的破坏（SYNTHESIA）。AJS2001通过VSV-G与细胞膜接触，然后以内吞的过程（ENDOPROCESSING）将病毒颗粒“卷入”细胞内。感染过程对细胞本身是不产生损害的。AJS2001在基因结构上去除了编码HIV-1 GP120的DNA，还将具有加强感染作用的“NEF”基因去除。AJS2001在保留HIV-1编码复制和结构蛋白基因成分的基础上，还保留了HIV-1的最重要的CIS基因成分，因此病毒基因组的整合过程正常，蛋白质的合成和加工不受阻碍，保证了病毒滴度处于较高水平（1500ng/ml），更保证了病毒的感染活性。这是目前第四代LENTIVIRUS载体所无法达到的。 AJS2001能够感染细胞，但仅此一次而已。在被感染的细胞内，AJS2001的PROVIRUS由于缺乏GP120基因，也缺乏其他能包装病毒的被膜蛋白质，因此AJS2001无法再产生新的病毒颗粒，即它是病毒复制的“残缺”型（INCOMPETENCE）。由于这样的“残缺”，AJS2001通过其他的遗传复制和重组机制而产生有复制能力的病毒颗粒的可能性微乎甚微，目前全世界的HIV-1实验室还没有哪一位发现这样的“重组”，使“残缺”病毒得以复制。因此，AJS2001是一种复制缺陷的由HIV-1经基因工程改造的LENTIVIRUS载体。 AJS2001载体与“众”不同的最主要一点是，它在增殖旺盛的细胞内，如癌细胞内，具有非常活跃的病毒基因表达活动，而在正常的细胞内，这一活动处于很低的水平。这是通过在HIV-1基因组内装载hTERT基因转录控制成分而实现的。由于hTERT基因转录控制成分在约90%的人的肿瘤细胞内具有活性，在正常的体细胞内活性很低，或没有活性。因此AJS2001对癌细胞的生物学作用非常特异（4）。除此之外，装载在HIV-1基因组内的hTERT基因转录控制成分还对HIV-1的PROVIRUS的基因表达起到调节控制作用（3），这就更有效地控制了基因转导（TRANSDUCTION）。 5．AJS2001“药效”学的研究 与传统的化学药物不同，AJS2001的“药效”学，“药物代谢动力”学特性实际上就是病毒的生物学，而以病毒感染和PROVIRUS的细胞和分子生物学最具有意义。有一点需要强调的是，AJS2001的制备来自体外培养的人的肾胚胎293T细胞，它除了病毒颗粒本身外，可能包含的“杂质”应属于正常人体细胞的产物。AJS2001最主要的“药效”学就是抑制癌细胞DNA复制，阻断癌细胞的增殖周期的运行，诱导癌细胞发生终末分化，自身死亡，或者使其丧失增殖能力。 经过长期、深入研究癌的生物学和发病原理，目前知道癌是一种由于基因结构或功能发生障碍而导致的细胞病变（5）。与正常细胞明显不同，癌细胞能够自主发出细胞生长的信号；癌细胞能够无限制地增殖，能产生血管生成素，促进周边的癌细胞旺盛地生长；大部分的癌细胞能够逃逸自身死亡的控制，并且对限制生长的调节失去反应；大量癌细胞的迅速生长又破坏了周围的正常细胞和组织，并且不断扩散和侵润，发生远处的转移。因此，癌是一种有严密控制和协调生长的细胞群体，要有效地抑制癌细胞生长，就必须在细胞和分子水平上打乱这一精密调控。最理想的方法就是使用“癌细胞增殖的征服者”来消除癌细胞内由于基因病变所产生的恶果。AJS2001就是这样一种癌细胞恶性增殖的“征服者”。 5-1）AJS2001诱导人的神经母细胞瘤（NEUROBLASTOMA）自身死亡的研究 在14种不同的人的神经母细胞瘤细胞系中有11种表达不同水平的CDC6，其中LA-N-2和CHLA255里CDC6可水平表达，FIG02A]。CDC6是细胞DNA复制启始蛋白质，DNA合成的启动必须要有CDC6与染色体DNA复制源（ORIGIN）的相互作用（6）。用THTD（m.o.i.为1.0）感染LA-N-2和CHLA255细胞48小时后，流式细胞分析DNA合成的PI 染色，subG1细胞成分增加了60-70%，FIG03]，THTD感染的细胞ANNEXIN V染色阳性上升了70%，并伴随BCL-2蛋白质的降低，而BAX明显增加，FIG04]。因此，THTD感染使人的神经母细胞瘤LA-N-2和CHLA255出现明显的自身死亡。 5-2）AJS2001诱导人的乳腺癌MCF7细胞丧失增殖能力 虽然THTD能使人的神经母细胞瘤死亡，但不能诱导MCF7死亡。被THTD病毒感染的MCF7细胞却在48小时后逐渐丧失增殖能力，即发生了SENESCENCE。这种细胞能够产生SENESCENCE-ASSOCIATED b-GLACTOSIDASE（SA-b-GLA）。更有意义的是，在这种细胞的细胞核内，用抗第九位赖氨酸双或三甲基化的组蛋白H3（H3K9me2/me3）的抗体间接萤光免疫染色，能够检测到特异的SAHF（7），FIG06]。这说明THTD能够使MCF7细胞再也不能增殖了。 5-3）THTD抑制CDC6表达，重新激活肿瘤抑制蛋白P16-RB调节控制 MCF7细胞内有相当水平的P16蛋白质。P16最主要的功能就是抑制含有D型细胞周期调控因子（CYCLIN D）和蛋白磷酸化激酶4或激酶6（CDK4/CDK6）（8）。由于这样的抑制，CYCLIN D和CDK4/CDK6无法对肿瘤抑制蛋白RB进行磷酸化反应，因此就无法消除RB抑制一种与细胞增殖极其相关的基因转录激活蛋白E2F。癌细胞里P16和RB的活性都遭遇不同程度的丢失或阻断（9），而CDC6又得到一定程度的活化，并在基因水平上对P16产生抑制作用（10）。THTD感染MCF7细胞后，CDC6的表达受到明显抑制，FIG02B]。由于细胞内CDC6的消除，对P16的抑制也随着减弱或被去除，这就使得P16重新活化，反过来抑制CYCLIN D和CDK4/CDK6，因此RB得以牢牢控制E2F，同时P16-RB的活化促使细胞发生增殖能力丧失的过程，也就是说细胞的增殖被阻断了。用抗P16的抗体免疫沉淀（IP）加上体外的非放射性同位素体系进行的蛋白磷酸化激酶反应，可以检测到，THTD感染的MCF7细胞对RB蛋白质磷酸化反应被明显抑制，这样的抑制作用至少在25倍以上，FIG08A，B]。用抗CDC6抗体免疫消除CDC6也能有效地抑制MCF7细胞对RB的磷酸化反应，FIG08C]。 5-4）THTN对接种的人的乳腺癌细胞生长的抑制 尽管许多HIV-1病毒蛋白质对小鼠细胞没有明显作用，但VPR，VIF等病毒蛋白对人的细胞的增殖却有一定抑制作用。在裸小鼠体内接种人的癌细胞后，肿瘤生长迅速。将THTN直接注射入癌病灶中，注射后的两周时间可以观察到肿瘤体积的缩小，或瘤体增大被明显抑制。而注射无病毒的1倍PBS的肿瘤增长没有变化。带瘤小鼠经过三周的饲养，处于濒临死亡状态，或死亡。而经THTN注射的带瘤小鼠由于瘤体不能迅速增长，经过同样时间，生长基本不受影响。 5-5）检测THTN的整合 检测AJS2001的整合可以确定细胞受到病毒感染，更重要的是确定在被感染细胞中有无新的被复制的病毒颗粒的产生。为什么不直接检测病毒HIV基因成分，而要检测HIV整合？因为检测的方法主要是体外DNA聚合酶扩增反应（POLYMERASE CHAIN REACTION，PCR），这样PCR无法区别检测到的HIV基因的来源，即来自感染细胞染色体DNA，还是来自污染的含HIV基因成分的质粒DNA。检测病毒整合，需要从被感染细胞中分离出染色体DNA，再将DNA用特殊的内切酶（RESTRICTION ENDONUCLEASE）消化，最后在进行PCR前再在酶切断端接上特别的连接核酸链（OLIGOERNUCLEOTIDE ADAPTOR）。这样消除了PCR扩增被污染的含HIV基因成分。THTN感染人的宫颈癌细胞后，用BPM-LTR-TAG方法进行检测，THTN整合于癌细胞染色体DNA的任何部位的DNA都有可能进行DNA测序[未发表研究资料]。THTN只能经历一次这样的感染和整合过程，在感染的HeLa细胞中，尽管有病毒蛋白质的合成，但由于缺乏GP120或VSV-G这样的病毒被膜蛋白质，不能产生新的病毒颗粒。用收集的培养液再与未被感染的HeLa细胞培育，并且分离这些细胞的染色体DNA，采用同样的BPM-LTR-TAG方法进行检测，结果是阴性的。这证明AJS2001的使用是安全的。 6．参考文献 1. Takakura M, Kyo S, Kanaya T, Hirano H, Takeda J, Yutsudo M, Inoue M. Cloning of human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene promoter and identification of proximal core promoter sequences essential for transcriptional activation in immortalized and cancer cells. Cancer Res. 1999;59:551-557. 2. Feng L, Wu M.The use of recombinant retrovirus in human cancer gene therapy (review, in Chinese). Current Biology in China 1987; (5):1-6. 3． Jing SQ, Zhang LH, Fan J, Guo LP, Feng L. Transcriptional and post-transcriptional control executed by a human immunodeficiency virus type 1 based recombinant retrovirus leads to the suppression of human cancer cell (Abstract #828). The American Society of Gene Therapy’s 5th Annual Meeting, Boston, Massachusetts, USA; 2002. 4． Koga S, Hirohata S, Kondo Y, Komata T, Takakura M, Inoue M, Kyo S, Kondo S. A novel telomerase-specific gene therapy: gene transfer of caspase-8 utilizing the human telomerase catalytic subunit gene promoter. Hum. 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